病例摘要
47歲女性,有吸煙史（5包/年，7年前戒煙）。主要癥狀為咳嗽，左側(cè)胸痛，診斷為社區(qū)獲得性肺炎。胸部和腹部的CT掃描顯示LLL病變，病理性淋巴結(jié)病變（左側(cè)縱隔，左側(cè)肺門和右側(cè)鎖骨上）以及肝臟病變。腦MRI沒有明顯顱內(nèi)病變。
腫瘤類型：LLL病變的CT引導(dǎo)下活檢顯示NSCLC，肺腺癌。相關(guān)標(biāo)記：CK7，TTF1，MOC-31和細胞角蛋白34βE12免疫染色陽性。初始分子研究：EGFR外顯子18-21的測序未顯示任何EGFR突變。ALK熒光原位雜交（FISH）陽性。67％ALK重排陽性。
討論
?針對ALK重排的常用檢測方法有哪些？
?針對這個患者可以采用什么樣的治療方案？
ALK陽性非小細胞肺癌是指包括ALK FISH檢測、或ALK序列融合變異、或ALK融合蛋白IHC特定方法檢測陽性的肺癌，是非小細胞肺癌的一個分子亞型，常見于腺癌，該類患者通常可從ALK抑制劑治療中獲益。
1.ALK測試有哪些可接受的方法？
肺癌中ALK變異主要為ALK基因發(fā)生重排與其他基因融合。其中，EML4-ALK（棘皮動物微管結(jié)合蛋白樣4-間變性淋巴瘤激酶）融合基因變異是其主要類型，約占所有NSCLC的5%左右。
ALK可以與包括EML4，KIF5B和TFG在內(nèi)的多種不同的配偶體基因進行重排，從而產(chǎn)生多種不同的轉(zhuǎn)錄物和融合蛋白。針對ALK靶點的小分子抑制劑Crizotinib（Crizotinib）是一種ATP競爭性酪氨酸激酶抑制劑，可特異性靶向抑制ALK激酶，也可抑制c-MET和ROS1等信號通路。CAP/IASLC/AMP選擇肺癌患者進行EGFR和ALK酪氨酸激酶抑制劑分子檢測指南于2013年7月發(fā)布（Lindeman，2013）。 2017年該指南將進行更新，預(yù)計將在今年晚些時候出版。更新后的指南重申并更新了2013年的大部分指南，并納入了一些重要的新建議，包括檢測所有肺腺癌患者的ROS1基因重排情況。
目前針對ALK融合基因檢測常用的方法有三種——熒光原位雜交（FISH）、基于PCR擴增技術(shù)（RACE-PCR或RT-PCR聯(lián)合測序技術(shù)、qRT-PCR等）和免疫組織化學(xué)法（IHC）。由于大量的配偶體基因和可能的重排，RT-PCR不是一種理想的篩選方法。ALK重排檢測策略可能包括FISH，IHC，甚至下一代測序（NGS）。
FISH雖然是臨床試驗驗證的標(biāo)準(zhǔn)方法，但價格昂貴，操作規(guī)范要求較高，且不能區(qū)分ALK融合變體（fusion variants）的類型；RT-PCR對標(biāo)本取材要求較高，需專用的試劑盒進行檢測；IHC簡便易行，但陽性標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一。
大部分Crizotinib治療ALK融合陽性NSCLC的臨床試驗均是基于FISH的診斷，因此，F(xiàn)ISH檢測目前仍是診斷ALK融合基因的參照標(biāo)準(zhǔn)方法。FDA已批準(zhǔn)的雅培FISH分離探針試劑盒（Vysis ALK Break Apart FISH Probe Kit）可用于診斷ALK融合基因的表達。該試劑盒設(shè)計的兩種探針分別標(biāo)記ALK基因的兩端，300 kb的3’端和442 kb的5’端分別標(biāo)記為橘紅色和綠色。在無ALK融合基因表達的腫瘤細胞中，橘紅色和綠色重疊為黃色或者相互粘合（兩個信號之間的間隔小于兩個信號的直徑）；而在存在ALK融合基因表達的腫瘤細胞中，橘紅色和綠色信號相互分離（間隔≥2個信號直徑）。標(biāo)本FISH陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為單個視野中的50個肺癌細胞中至少有25個存在分離信號，或者兩個不同視野中的100個肺癌細胞中至少有15個存在分離信號。詳細的FISH陽性判讀標(biāo)準(zhǔn)可參見雅培ALK分離FISH探針試劑盒說明書。
ALK FISH技術(shù)適用的組織樣本類型：10％中性福爾馬林固定后石蠟包埋標(biāo)本（FFPE樣本），防脫玻片切片厚度3~5μm。
原位雜交技術(shù)檢測ALK變異也存在不足之處。首先，F(xiàn)ISH檢測對于操作和判讀技術(shù)要求較高，診斷醫(yī)師必須經(jīng)過嚴(yán)格的FISH操作和結(jié)果判讀培訓(xùn)。只有經(jīng)FISH操作經(jīng)驗豐富的醫(yī)師判定的結(jié)果才具有可靠性。其次，晚期NSCLC患者通常只能提供2mm左右的小活檢組織，很難保證每個視野均存在50個以上的肺癌細胞進行陽性判讀。FISH檢測結(jié)果的判斷界值（cut off）也存在商榷之處，研究發(fā)現(xiàn)少數(shù)ALK FISH陰性、IHC陽性的患者能從靶向藥物明顯獲益。最后，目前FISH檢測的成本昂貴，且不能明確ALK融合基因的具體融合變體。因此，雖然FISH檢測仍是診斷的重要手段，但現(xiàn)階段尚無法適用于中國ALK陽性NSCLC患者的大規(guī)模篩查和診斷。
2.針對這個患者可以采用什么樣的治療方案？
2007年，肺癌患者首次檢測到涉及編碼ALK酪氨酸激酶基因的染色體重排（Soda，2007）。ALK重排在非小細胞肺癌中高達7％（Kris，2014）。 ALK重排的存在賦予對ALK抑制劑的敏感性（Kwak，2010）。Crizotinib是FDA批準(zhǔn)的用于治療ALK + NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)方案。
與鉑類化療相比，第一代crizotinib已經(jīng)在晚期ALK + NSCLC患者中顯示出顯著的活性，RR為74％，PFS為10.9個月（風(fēng)險比為0.45）（Solomon and Mok，2015）。
第一代crizotinib是一種ALK / ROS1 / MET抑制劑，最初于2011年被美國FDA批準(zhǔn)用于治療晚期ALK + NSCLC。在兩項隨機III期試驗（PROFILE 1014和PROFILE 1007）中，與一線和二線細胞毒性化療相比，crizotinib分別使ORR，PFS和生活質(zhì)量得到顯著改善（Shaw，2013）（Solomon，2014）。與此例特別相關(guān)的是，在第一線crizotinib的PROFILE 1014試驗中，與基于鉑的化療（Solomon和Mok，2015）相比，RR為74％，PFS為10.9個月（風(fēng)險比為0.45）?；谶@些研究，crizotinib成為晚期ALK陽性NSCLC的標(biāo)準(zhǔn)一線治療藥物。
雖然crizotinib已經(jīng)改變了ALK + NSCLC的管理，但是2017年，還有一線ALK導(dǎo)向治療的其他選擇。
Ceritinib是第二代ALK TKI，具有增加的針對ALK的靶向活性（Mehra，2012）。基于ASCEND-1研究（Kim，2016）（Shaw and Engelman，2014），ceritinib最初是FDA批準(zhǔn)用于一線crizotinib后發(fā)展為進展性疾病的患者。最近報道了ASCEND-4試驗的結(jié)果（Soria，2017）。本研究將376例晚期治療的ALK +肺癌患者隨機分入ceritinib（189例）或鉑 - 培美曲塞二聯(lián)治療（187例）。 Ceritinib組的中位PFS為16.6個月，而化療組為8.1個月（HR 0.55,95％CI 0.42-0.73; P <0.0001）。使用ceritinib的中位緩解時間為23.9個月，化療為11.1個月。值得注意的是，ceritinib的顱內(nèi)反應(yīng)率為57％，而化療為22％。Ceritinib最常見的不良反應(yīng)是腹瀉，惡心，嘔吐，疲勞和腹痛。
2017年5月，F(xiàn)DA擴大了對ceritinib適應(yīng)證的批準(zhǔn)，用于ALK陽性的轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌(NSCLC)患者的一線治療。
Alectinib是另一種第二代ALK TKI，其對ALK的靶向活性增加（Sakamoto，2011）。與ceritinib類似，根據(jù)兩項單一研究（NP28673和NP28761）（Ou，2016）（Shaw，2016），alectinib最初是FDA批準(zhǔn)用于一線crizotinib后發(fā)展為進展性疾病的患者。今年，在ASCO年會上，Global-ALEX研究的結(jié)果被提出，這項研究比較了alectinib和crizotinib的一線藥物。本研究隨機對303例晚期ALK + NSCLC患者進行alectinib或crizotinib治療。中位PFS為alectinib為25.7個月，crizotinib為10.4個月。 12個月時，alectinib（9％）與crizotinib（41％）相比，腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率更低。Alectinib最常見的不良反應(yīng)是疲勞，便秘，肌肉疼痛和腫脹。
病例更新
該患者接受crizotinib治療。1個月內(nèi)癥狀好轉(zhuǎn)，咳嗽減少，疼痛明顯減輕。Crizotinib2周期后，CT掃描顯示胸部和肝臟的腫瘤減小。占主導(dǎo)地位的左側(cè)病灶尺寸從5.8×3.1厘米減小到4.6×1.7厘米。
該患者繼續(xù)服用crizotinib14個月，此時間隔CT掃描顯示肝臟有進行性疾病。
討論
?Crizotinib獲得性耐藥的機制是什么？
?Crizotinib治療后，二線治療方案是什么？
盡管crizotinib初始反應(yīng)良好,但大部分患者在治療1年內(nèi)耐藥出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā),被稱為獲得性耐藥。
1.Crizotinib獲得性耐藥的機制是什么？
Crizotinib耐藥的機制與EGFR TKI相似，包括激酶結(jié)構(gòu)域點突變，基因擴增和旁路信號通路激活。首個crizotinib獲得性耐藥的報道中，將一位接受crizotinib治療復(fù)發(fā)后的腹水標(biāo)本深度測序，結(jié)果提示兩個不重疊的ALK酪氨酸激酶區(qū)域的突變，L1196M和C1156Y。體外實驗提示以上任何一種突變都可以導(dǎo)致crizotinib的耐藥。隨后，其他ALK激酶區(qū)域的耐藥突變在患者樣本中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，如G1269A、1151Tins、L1152R、1202R和1206Y。此外，ALK融合基因擴增在體內(nèi)外已經(jīng)被鑒定為耐藥的原因?？傊?，大約三分之一的患者接受crizotinib治療過程中復(fù)發(fā)是由于ALK耐藥突變或ALK融合基因的擴增。第二種耐藥機制為其他ALK相關(guān)信號通路的激活。體外研究提示，EGFR和`其他HER家族受體酪氨酸激酶能夠通過配體介導(dǎo)激活A(yù)LK受體而導(dǎo)致耐藥。此外，C-KIT基因擴增也可導(dǎo)致crizotinib耐藥。其他潛在旁路機制包括EGFR和KRAS的激活突變等。
高達50％的第二代ALK抑制劑患者獲得了ALK突變（G1202R，G1202 del，V1180L，S1206Y，E1201K等）（Gainor，2016）。值得注意的是，G1202R突變似乎是最頑固的。
腫瘤可能同時或逐步采用多種耐藥機制，如何克服二線和三線的耐藥是目前的挑戰(zhàn)。
2.Crizotinib治療后，二線治療方案是什么？
目前已經(jīng)開發(fā)了多個“第二”甚至“第三”代ALK抑制劑來嘗試克服Crizotinib耐藥性（表1）。這些“下一代”ALK抑制劑對ALK具有更高的靶向選擇性和效力，并且與Crizotinib相比也具有更強的CNS滲透。這個領(lǐng)域的進展非常迅速，關(guān)于這個話題有很多信息。下面將重點總結(jié)那些已經(jīng)獲得監(jiān)管部門批準(zhǔn)的靶向藥物。
表1 ALK抑制劑
Ceritinib是FDA批準(zhǔn)用于治療Crizotinib耐藥或不耐受的ALK陽性NSCLC。在兩項研究中評估了Crizotinib耐藥患者中的Ceritinib活性。
ASCEND-1是一項單獨的I期試驗，其中163名ALK抑制劑預(yù)處理的患者接受了ceritinib治療（Kim，2016）。 ORR為56％，中位PFS為6.9個月。反應(yīng)的中位數(shù)（DOR）為8.3個月。 75位患有腦轉(zhuǎn)移的ALK抑制劑預(yù)處理患者中，顱內(nèi)疾病控制率為65％。最常見的3-4級不良事件為腹瀉（6％），惡心（6％），ALT升高（30％）和AST升高（30％）。
ASCEND-2是一項II期臨床試驗，140名接受ALK抑制劑預(yù)處理的患者接受了每天750毫克的ceritinib（Crino，2016）。所有患者都曾接受過Crizotinib治療。 ORR為38.6％，中位PFS為5.7個月。中位DOR為9.7個月。顱內(nèi)ORR為45.0％。最常見的AES主要是1級和2級，包括：惡心（81.4％），腹瀉（80.0％）和嘔吐（62.9％）。
Alectinib也被FDA批準(zhǔn)用于Crizotinib耐藥或不耐受的ALK陽性非小細胞肺癌的治療。已經(jīng)在兩個單臂2期研究（NP28673和NP28761）中評估了alectinib對Crizotinib耐藥的患者的活性。
對于NP28761研究，87例全部接受Crizotinib治療的患者均接受Alectinib600 mg bid。 60％的患者有基線腦轉(zhuǎn)移。 ORR為48％，PFS為5.7個月（Shaw，2016）。中位DOR為13.5個月?；€時16例可測量的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的顱內(nèi)ORR為75％。中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)的中位持續(xù)時間為11.1個月。最常見的AE（大多為1級或2級）分別為便秘（36％），疲勞（33％），肌痛（24％）和外周性水腫（23％）。最常見的3-4級不良事件是CPK升高（8％），ALT升高（6％），AST升高（9％）。
對于NP28673研究，先前接受crizotinib的138名患者接受600mg bid的Alectinib。 ORR為50％，中位PFS為8.9個月（Ou，2016）。中位DOR為11.2個月。基線時35例可測量的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者的顱內(nèi)ORR為57％。中樞神經(jīng)系統(tǒng)反應(yīng)的中位持續(xù)時間為10.3個月。最常見的AE（大多為1級或2級）為便秘（33％），疲勞（26％）和外周性水腫（25％）。最常見的3-4級AE為呼吸困難（3％），ALT升高（2％）和AST升高（％）。
小結(jié)
1.目前針對ALK融合基因檢測常用的方法有三種——熒光原位雜交（FISH）、基于PCR擴增技術(shù)和免疫組織化學(xué)法（IHC）。
2.新一代測序（NGS）正迅速融入常規(guī)實驗室測試。
3.ALK TKI耐藥機制多種多樣，包括ALK激酶結(jié)構(gòu)域突變，ALK擴增，EMT和SCLC轉(zhuǎn)化。
4.四種不同的ALK TKIs已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于ALK + NSCLC患者。
目前僅有10年的臨床前報告記錄了NSCLC患者中ALK重排的情況（Soda，2007），該領(lǐng)域發(fā)展迅速而且顯著，到目前為止我們有強有力的證據(jù)顯示，未來的鑒定和治療以ALK為目標(biāo)應(yīng)該是治療的標(biāo)準(zhǔn)。四種不同的ALK TKIs已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)用于ALK + NSCLC患者，并且患者現(xiàn)在正在用多種ALK TKI療法進行常規(guī)治療。其他的ALK TKI也正在開發(fā)中,希望更多的患者獲益。
參考文獻
[1]Lung Cancer (August 2017): Molecular Oncology Tumor Boards.ASCO University.
[2]張緒超, 陸舜, 張力,等. 中國間變性淋巴瘤激酶(ALK)陽性非小細胞肺癌診斷專家共識(2013版)[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2013, 42(6):402-406.
