首次在新的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行體內(nèi)人基因組編輯測(cè)試
時(shí)間：2017-05-22 13:27:55 來源：生物谷 點(diǎn)擊：
科學(xué)家們之前已編輯過人基因組，但總是在體外的細(xì)胞中開展的。如今，作為一家生物技術(shù)公司，Sangamo治療公司（Sangamo Therapeutics，以下稱Sangamo）正在招募參與者參加幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)：血友病B、赫勒綜合征（Hurler syndrome）或亨特綜合征（Hunter syndrome）患者具有非功能性的酶，通過鋅指核酸酶（ZFN）在他們的基因組上產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂，將編碼功能性酶的基因插入到他們的基因組上。
Sangamo公司總裁兼首席執(zhí)行官Sandy Macrae告訴《科學(xué)家》雜志，“這是首次一個(gè)人可能在其肝臟中具有一種新的基因。開展這些臨床試驗(yàn)是一種榮幸，也是一種責(zé)任。”
Sangamo公司將重點(diǎn)關(guān)注的疾病之一是血友病B，它是由F9基因存在缺陷或缺失導(dǎo)致的一種嚴(yán)重的出血性疾病。這個(gè)基因的蛋白產(chǎn)物，即凝血因子IX，是血液凝結(jié)所必不可少的一種酶。
兩種其他的臨床試驗(yàn)將著重關(guān)注赫勒綜合征和亨特綜合征。這兩種疾病的患者缺乏兩種不同基因的一種功能性拷貝。這兩種基因編碼降解參與發(fā)育、血管生成等過程的復(fù)雜多糖的酶。若沒有這些酶，被稱作糖胺聚糖（glycosaminoglycan）的特定多糖類型在細(xì)胞中堆積，這能夠?qū)е律窠?jīng)問題、心血管疾病和其他癥狀。
在所有的這三項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，ZFN在人肝細(xì)胞中的白蛋白編碼基因的靶位點(diǎn)上進(jìn)行切割，隨后這種基因的一種功能性拷貝通過同源重組而被整合到肝細(xì)胞的基因組中。
一項(xiàng)臨床試驗(yàn)的初步階段涉及6名血友病B患者，這些患者每個(gè)將接受低劑量、中劑量或高劑量SB-FIX藥物靜脈注射，這種藥物由三種腺相關(guān)病毒（AAV）組成：兩種AAV含有產(chǎn)生ZFN的基因，第三種AAV含有功能性的F9基因。
Macrae說，研究人員期待F9 DNA將被整合到少量肝細(xì)胞中的白蛋白編碼基因的靶位點(diǎn)上，但是鑒于白蛋白在肝臟中高度表達(dá)，這些患者的凝血因子IX水平仍然能夠增加。一旦Sangamo公司評(píng)估了這種藥物的安全性和確定了它的最佳劑量，還有三名血友病B患者將作為最佳劑量組的一部分參加這項(xiàng)臨床試驗(yàn)。
美國(guó)圣裘德兒童研究醫(yī)院兒科外科醫(yī)生Andrew Davidoff說，血友病B是“第一種能夠靶向的疾病，這是因?yàn)檫@種疾病生理學(xué)特征是非常明確的”。他解釋道，“如果你僅是替換這種缺失的或缺陷性的凝血因子，那么你將實(shí)際上治愈這些患者。”
Davidoff沒有參與Sangamo公司即將開展的臨床試驗(yàn)，但是他已領(lǐng)導(dǎo)了血友病B男性患者的臨床試驗(yàn)：AAV病毒將F9的一種功能性拷貝運(yùn)送到肝臟中。在Davidoff的臨床試驗(yàn)中，這個(gè)基因盒并沒有整合到病人的基因組中，而是作為被稱作附加體（episome）的基因組外DNA存在于肝細(xì)胞中。Davidoff解釋道，“鑒于沒有整合，如果靶細(xì)胞發(fā)生分裂，那么就可能丟失這些附加體。”
但是，即便F9沒有整合到基因組中，在Davidoff的臨床試驗(yàn)中接受這種治療的這些男性患者仍然增加表達(dá)這種凝血因子，從而導(dǎo)致臨床癥狀改善。這些最早的參與者已在7年多的時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出一致性的循環(huán)凝血因子IX水平。Davidoff說，“有些令人吃驚的是，情況一直很穩(wěn)定。答案的一部分在于在沒有創(chuàng)傷或外科手術(shù)的情形下，肝細(xì)胞很少發(fā)生分裂。”
Macrae說，在當(dāng)前的臨床試驗(yàn)中，Sangamo策略的一種優(yōu)勢(shì)在于它是“一種終生解決方案”。一旦這些ZFN促進(jìn)F9基因的功能性拷貝整合到參與者的肝細(xì)胞基因組中，該基因就應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定地表達(dá)。
美國(guó)南加州大學(xué)凱克醫(yī)學(xué)院基因療法研究員Paula Cannon將這種白蛋白編碼基因描述為一種“安全港位點(diǎn)”---通過實(shí)驗(yàn)確定適合基因插入和長(zhǎng)期表達(dá)的基因組位點(diǎn)。Cannon并未參與當(dāng)前的這些臨床試驗(yàn)，但是她之前與Sangamo公司合作利用ZFN將一種基因整合到人細(xì)胞中，從而使得這些細(xì)胞的后代抵抗HIV感染。
Cannon 告訴《科學(xué)家》雜志，ZFN和CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)都能夠以一種位點(diǎn)特異性的方式切割DNA，但是她補(bǔ)充道，在開發(fā)臨床療法時(shí)，ZFN也存在優(yōu)勢(shì)。比如，CRISPR/Cas9存在一些限制，也就是，結(jié)合到靶序列上的向?qū)NA（gRNA）必須附著到一個(gè)錨定序列（通常含有兩個(gè)G堿基）上。她說，因此CRISPR/Cas9“并不會(huì)提供你想要的高度特異性。”
Cannon補(bǔ)充道，“ZFN有點(diǎn)較難以開發(fā)”，但是Sangamo公司開發(fā)的系統(tǒng)“給你提供非常特異性的和高度有效的ZFN。他們能夠讓ZFN切割任何一種特定的堿基。”
Cannon強(qiáng)調(diào)的ZFN的另一種優(yōu)勢(shì)是它們的歷史和被美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)作為試驗(yàn)性新藥。ZFN已成功地被用來敲除一種參與HIV入侵人T細(xì)胞的基因，而且當(dāng)被注射到人體中時(shí)，這些細(xì)胞并沒有引發(fā)免疫反應(yīng)。
ZFN的另一種益處在于它們比Cas9小，而Cas9是CRISPR/Cas9系統(tǒng)所必需的。Cannon說，“當(dāng)在體外編輯細(xì)胞時(shí)，這并不重要。但是如果你想在體內(nèi)處理組織，正如當(dāng)前的這項(xiàng)臨床試驗(yàn)?zāi)菢?，那么你?huì)研究一類被稱作AAV的載體。真地很難將Cas9插入到這類載體中，這是因?yàn)樗罅恕?rdquo;
但是，體內(nèi)基因組編輯的一些障礙是普遍存在的。美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)家Robert Doms（未參與當(dāng)前的這些臨床試驗(yàn)）說，“不論使用ZFN或者類似的TALEN或CRISPR/Cas9系統(tǒng)，它們都存在運(yùn)送問題，也就是如何將感興趣的產(chǎn)物運(yùn)送到特定的細(xì)胞而不是其他的細(xì)胞中。不論嘗試著做什么，這都是基因療法面臨著的一項(xiàng)挑戰(zhàn)。”
針對(duì)Sangamo公司當(dāng)前的臨床試驗(yàn)而言，將這些藥物中的任何一種運(yùn)送到肝臟中是相當(dāng)簡(jiǎn)單的，這是因?yàn)锳AV很容易經(jīng)過血液入侵肝細(xì)胞。Macrae解釋道，其他的研究團(tuán)隊(duì)已成功地將AAV運(yùn)送到眼睛中，而且Sangamo公司可能很快對(duì)AAV到大腦中的運(yùn)送進(jìn)行優(yōu)化。但是他同意將藥物運(yùn)送到合適的組織中是一個(gè)迫在眉睫的問題。他說，“我相信未來使用和編輯應(yīng)用的秘密在于運(yùn)送。”
Sangamo公司總裁兼首席執(zhí)行官Sandy Macrae告訴《科學(xué)家》雜志，“這是首次一個(gè)人可能在其肝臟中具有一種新的基因。開展這些臨床試驗(yàn)是一種榮幸，也是一種責(zé)任。”
Sangamo公司將重點(diǎn)關(guān)注的疾病之一是血友病B，它是由F9基因存在缺陷或缺失導(dǎo)致的一種嚴(yán)重的出血性疾病。這個(gè)基因的蛋白產(chǎn)物，即凝血因子IX，是血液凝結(jié)所必不可少的一種酶。
兩種其他的臨床試驗(yàn)將著重關(guān)注赫勒綜合征和亨特綜合征。這兩種疾病的患者缺乏兩種不同基因的一種功能性拷貝。這兩種基因編碼降解參與發(fā)育、血管生成等過程的復(fù)雜多糖的酶。若沒有這些酶，被稱作糖胺聚糖（glycosaminoglycan）的特定多糖類型在細(xì)胞中堆積，這能夠?qū)е律窠?jīng)問題、心血管疾病和其他癥狀。
在所有的這三項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，ZFN在人肝細(xì)胞中的白蛋白編碼基因的靶位點(diǎn)上進(jìn)行切割，隨后這種基因的一種功能性拷貝通過同源重組而被整合到肝細(xì)胞的基因組中。
一項(xiàng)臨床試驗(yàn)的初步階段涉及6名血友病B患者，這些患者每個(gè)將接受低劑量、中劑量或高劑量SB-FIX藥物靜脈注射，這種藥物由三種腺相關(guān)病毒（AAV）組成：兩種AAV含有產(chǎn)生ZFN的基因，第三種AAV含有功能性的F9基因。
Macrae說，研究人員期待F9 DNA將被整合到少量肝細(xì)胞中的白蛋白編碼基因的靶位點(diǎn)上，但是鑒于白蛋白在肝臟中高度表達(dá)，這些患者的凝血因子IX水平仍然能夠增加。一旦Sangamo公司評(píng)估了這種藥物的安全性和確定了它的最佳劑量，還有三名血友病B患者將作為最佳劑量組的一部分參加這項(xiàng)臨床試驗(yàn)。
美國(guó)圣裘德兒童研究醫(yī)院兒科外科醫(yī)生Andrew Davidoff說，血友病B是“第一種能夠靶向的疾病，這是因?yàn)檫@種疾病生理學(xué)特征是非常明確的”。他解釋道，“如果你僅是替換這種缺失的或缺陷性的凝血因子，那么你將實(shí)際上治愈這些患者。”
Davidoff沒有參與Sangamo公司即將開展的臨床試驗(yàn)，但是他已領(lǐng)導(dǎo)了血友病B男性患者的臨床試驗(yàn)：AAV病毒將F9的一種功能性拷貝運(yùn)送到肝臟中。在Davidoff的臨床試驗(yàn)中，這個(gè)基因盒并沒有整合到病人的基因組中，而是作為被稱作附加體（episome）的基因組外DNA存在于肝細(xì)胞中。Davidoff解釋道，“鑒于沒有整合，如果靶細(xì)胞發(fā)生分裂，那么就可能丟失這些附加體。”
但是，即便F9沒有整合到基因組中，在Davidoff的臨床試驗(yàn)中接受這種治療的這些男性患者仍然增加表達(dá)這種凝血因子，從而導(dǎo)致臨床癥狀改善。這些最早的參與者已在7年多的時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出一致性的循環(huán)凝血因子IX水平。Davidoff說，“有些令人吃驚的是，情況一直很穩(wěn)定。答案的一部分在于在沒有創(chuàng)傷或外科手術(shù)的情形下，肝細(xì)胞很少發(fā)生分裂。”
Macrae說，在當(dāng)前的臨床試驗(yàn)中，Sangamo策略的一種優(yōu)勢(shì)在于它是“一種終生解決方案”。一旦這些ZFN促進(jìn)F9基因的功能性拷貝整合到參與者的肝細(xì)胞基因組中，該基因就應(yīng)當(dāng)穩(wěn)定地表達(dá)。
美國(guó)南加州大學(xué)凱克醫(yī)學(xué)院基因療法研究員Paula Cannon將這種白蛋白編碼基因描述為一種“安全港位點(diǎn)”---通過實(shí)驗(yàn)確定適合基因插入和長(zhǎng)期表達(dá)的基因組位點(diǎn)。Cannon并未參與當(dāng)前的這些臨床試驗(yàn)，但是她之前與Sangamo公司合作利用ZFN將一種基因整合到人細(xì)胞中，從而使得這些細(xì)胞的后代抵抗HIV感染。
Cannon 告訴《科學(xué)家》雜志，ZFN和CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)都能夠以一種位點(diǎn)特異性的方式切割DNA，但是她補(bǔ)充道，在開發(fā)臨床療法時(shí)，ZFN也存在優(yōu)勢(shì)。比如，CRISPR/Cas9存在一些限制，也就是，結(jié)合到靶序列上的向?qū)NA（gRNA）必須附著到一個(gè)錨定序列（通常含有兩個(gè)G堿基）上。她說，因此CRISPR/Cas9“并不會(huì)提供你想要的高度特異性。”
Cannon補(bǔ)充道，“ZFN有點(diǎn)較難以開發(fā)”，但是Sangamo公司開發(fā)的系統(tǒng)“給你提供非常特異性的和高度有效的ZFN。他們能夠讓ZFN切割任何一種特定的堿基。”
Cannon強(qiáng)調(diào)的ZFN的另一種優(yōu)勢(shì)是它們的歷史和被美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)作為試驗(yàn)性新藥。ZFN已成功地被用來敲除一種參與HIV入侵人T細(xì)胞的基因，而且當(dāng)被注射到人體中時(shí)，這些細(xì)胞并沒有引發(fā)免疫反應(yīng)。
ZFN的另一種益處在于它們比Cas9小，而Cas9是CRISPR/Cas9系統(tǒng)所必需的。Cannon說，“當(dāng)在體外編輯細(xì)胞時(shí)，這并不重要。但是如果你想在體內(nèi)處理組織，正如當(dāng)前的這項(xiàng)臨床試驗(yàn)?zāi)菢?，那么你?huì)研究一類被稱作AAV的載體。真地很難將Cas9插入到這類載體中，這是因?yàn)樗罅恕?rdquo;
但是，體內(nèi)基因組編輯的一些障礙是普遍存在的。美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)家Robert Doms（未參與當(dāng)前的這些臨床試驗(yàn)）說，“不論使用ZFN或者類似的TALEN或CRISPR/Cas9系統(tǒng)，它們都存在運(yùn)送問題，也就是如何將感興趣的產(chǎn)物運(yùn)送到特定的細(xì)胞而不是其他的細(xì)胞中。不論嘗試著做什么，這都是基因療法面臨著的一項(xiàng)挑戰(zhàn)。”
針對(duì)Sangamo公司當(dāng)前的臨床試驗(yàn)而言，將這些藥物中的任何一種運(yùn)送到肝臟中是相當(dāng)簡(jiǎn)單的，這是因?yàn)锳AV很容易經(jīng)過血液入侵肝細(xì)胞。Macrae解釋道，其他的研究團(tuán)隊(duì)已成功地將AAV運(yùn)送到眼睛中，而且Sangamo公司可能很快對(duì)AAV到大腦中的運(yùn)送進(jìn)行優(yōu)化。但是他同意將藥物運(yùn)送到合適的組織中是一個(gè)迫在眉睫的問題。他說，“我相信未來使用和編輯應(yīng)用的秘密在于運(yùn)送。”
