| 導(dǎo)讀 |
在尋找疾病相關(guān)基因的研究中，使用基因芯片對(duì)家系進(jìn)行連鎖分析，將基因定位于少數(shù)幾個(gè)區(qū)域中，接著進(jìn)行外顯子組測(cè)序或全基因組重測(cè)序?qū)ふ液蜻x區(qū)域中的遺傳變異，是一個(gè)準(zhǔn)確高效的研究方案。本文列舉了上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院皮膚科李明老師團(tuán)隊(duì)的兩項(xiàng)研究，均使用了上述方法成功找到了疾病相關(guān)的基因變異位點(diǎn)。
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在尋找疾病相關(guān)基因的研究中，使用基因芯片對(duì)家系進(jìn)行連鎖分析，將基因定位于少數(shù)幾個(gè)區(qū)域中，接著進(jìn)行外顯子組測(cè)序或全基因組重測(cè)序?qū)ふ液蜻x區(qū)域中的遺傳變異，是一個(gè)準(zhǔn)確高效的研究方案。本文列舉了上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院皮膚科李明老師團(tuán)隊(duì)的兩項(xiàng)研究，均使用了上述方法成功找到了疾病相關(guān)的基因變異位點(diǎn)。該研究中的Illumina Infinium Human OminiZhongHua-8基因芯片和外顯子組測(cè)序服務(wù)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供。
研究思路
研究案例
案例一 連鎖分析和重測(cè)序揭示Basan綜合征相關(guān)SMARCAD1突變
該研究使用了連鎖分析和全基因組重測(cè)序發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的SMARCAD1基因選擇性剪切突變，此突變被認(rèn)為引發(fā)了Basan綜合征。在此研究之前，已有研究在患有Basan綜合征的美國(guó)家庭鑒定出了SMARCAD1基因的5個(gè)突變。Basan綜合征是一種罕見(jiàn)的常染色體顯性遺傳病，癥狀為可自愈的先天性肢端水皰、粟丘疹、無(wú)指紋及掌跖角化過(guò)度等。本文的研究對(duì)象是一個(gè)患有Basan綜合征的家系（見(jiàn)圖1）。具體病征見(jiàn)表1。
圖1.1. 患有Basan綜合征的家系圖譜。箭頭所指為先證者。
表1. 家系中8例患Basan綜合征的臨床表現(xiàn)
研究首先使用了Illumina Infinium Human OminiZhongHua-8基因芯片對(duì)整個(gè)家系樣本進(jìn)行基因分型。過(guò)濾掉低質(zhì)量位點(diǎn)，單態(tài)位點(diǎn)，以及不符合孟德?tīng)柖傻奈稽c(diǎn)后，得到11,152個(gè)SNPs用于連鎖分析。由于Basan綜合征存在類(lèi)似遺傳性大皰性表皮松解癥的臨床表現(xiàn)，因此先排除掉已知相關(guān)基因KRT5的突變。隨后連鎖分析得到了兩個(gè)相關(guān)區(qū)域，為4p15.31-4p14和4q13.2-4q23。
圖1.2. 全基因組連鎖分析結(jié)果。最高LOD值為3.01。
接下來(lái)，研究使用了Agilent SureSelect平臺(tái)對(duì)其中一例患者進(jìn)行了外顯子測(cè)序，測(cè)序深度為100X，但并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)功能相關(guān)變異。于是作者又進(jìn)行了全基因組重測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq XTen，測(cè)序深度為平均每堿基27.94X，得到了3,832,626個(gè)變異位點(diǎn)（SNP和Indel）。在使用1000 Genome、HapMap 8和dbSNP135數(shù)據(jù)庫(kù)過(guò)濾SNP后，在連鎖分析得到的相關(guān)區(qū)域中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)遺傳變異。第一個(gè)為c.378 +1G>T，位于SMARCAD1基因的選擇性剪切位點(diǎn)，而另一個(gè)則為“GGC”重復(fù)，位于A(yíng)NKRD17基因的第一外顯子。隨后，作者使用了sanger測(cè)序?qū)@兩個(gè)變異在該家系中進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SMARCAD1基因的變異與臨床表現(xiàn)呈共分離，但ANKRD17基因與疾病無(wú)關(guān)。
本研究的意義在于確定了該家系發(fā)病原因?yàn)镾MARCAD1基因上發(fā)生的選擇性剪切突變。有研究報(bào)道，該突變與無(wú)掌紋癥（adermatoglphia，ADG）相關(guān)，說(shuō)明ADG與Basan綜合征是同一種疾病的不同表現(xiàn)。未來(lái)研究將解決該突變的致病機(jī)制。
案例二 全基因組連鎖分析和外顯子測(cè)序在Dowling-Degos病例中確定KRT5基因突變
Dowling-Degos病是一種色素性疾病，為常染色體顯性遺傳，特征為身體屈側(cè)有網(wǎng)狀色素沉著、顯著的粉刺樣皮疹和凹陷性瘢痕。本研究使用了患有Dowling-Degos病的家系作為研究對(duì)象，患者樣本數(shù)量為19個(gè)。
圖2.1. 患有Dowling-Degos病的家系圖譜。箭頭所指為先證者。
與上一篇研究類(lèi)似，作者首先使用了Sanger測(cè)序在樣本中排除了包含已知致病基因ABCB6、POFUT1和POGLUT1突變的樣本，隨后使用Illumina Infinium Human OminiZhongHua-8基因芯片進(jìn)行基因分型。連鎖分析將致病基因定位至12q13.12-12q14.1區(qū)域內(nèi)，LOD值為3.19，定位精度為13.76 cM。
圖2.2. Dowling-Degos病致病基因KRT5的定位。（a）單倍型分析；（b）連鎖分析，候選區(qū)域LOD值為3.19；（c）Sanger測(cè)序驗(yàn)證KRT5基因變異
隨后，對(duì)其中一例患者，研究者進(jìn)行了外顯子組測(cè)序，平臺(tái)為Agilent SureSelect，測(cè)序深度為100X。在定位區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了KRT5基因起始密碼子的突變c.2T>G (p.Met1?)和NEUROD4基因的一個(gè)錯(cuò)義突變c.376G>A (p. Ile126Val)。經(jīng)過(guò)使用Sanger測(cè)序進(jìn)行突變與疾病的共分離分析，后者被排除，而前者被證明與疾病相關(guān)。
總結(jié)
這兩篇文章均首先使用基因芯片進(jìn)行了連鎖分析，將候選基因定位于具體的區(qū)段上，再使用全基因組重測(cè)序?qū)ふ以搮^(qū)段的遺傳變異。定位到少數(shù)幾個(gè)變異后，使用Sanger測(cè)序?qū)φ麄€(gè)家系樣本進(jìn)行測(cè)序，將基因型與表現(xiàn)型進(jìn)行共分離分析，排除與疾病無(wú)關(guān)的遺傳突變。這種研究方法為遺傳性疾病致病基因搜尋提供了明確的研究思路。
原文出處：
Li M, Wang J, Li Z, et al. Genome-wide linkage analysis and whole-genome sequencing identify a recurrent SMARCAD1 variant in a unique Chinese family with Basan syndrome[J]. European Journal of Human genetics, 2016.
Li M, Wang J, Zhang J, et al. Genome-wide linkage and exome sequencing analyses identify an initiation codon mutation of KRT5, in a unique Chinese family with generalized Dowling–Degos disease[J]. British Journal of Dermatology, 2015, 174(3):663-666.
