什么叫做單細胞基因測序（Single-Cell Sequencing）？
一句話說，就是單個細胞水平上對基因組進行測序。2013年，自然雜志把年度技術(shù)授予了單細胞基因測序（Single Cell Sequencing），認為該技術(shù)將改變生物界和醫(yī)學(xué)界的許多領(lǐng)域。
我們?yōu)槭裁匆M行單細胞基因測序？
傳統(tǒng)的測序方法，無論是基因芯片或者二代基因測序技術(shù)（Next Generation Sequencing，NGS）都需要從超過10萬個細胞中提取一大堆（bulk）DNA或者RNA，而提供的信息是一大堆細胞的平均值。但是傳統(tǒng)的方法，對于理解人體細胞的多樣性有著明顯的局限性。
在人體的每一個組織中，比如說，腎臟組織，擁有著大量不同的細胞類型，每一種細胞類型有著獨特的起源和功能。每一個細胞的譜系和發(fā)展的狀態(tài)又決定了每個細胞如何和周圍的細胞和環(huán)境如何反應(yīng)，把基因測序應(yīng)用到單個細胞層面，對于我們理解細胞的起源，功能，變異等有著至關(guān)重要的作用。
關(guān)于二代基因測序已經(jīng)詳細在我們的前期兩篇深度報告中進行了介紹，在本篇報告中，我們將詳細解讀單細胞基因測序，以及該技術(shù)對癌癥，輔助生殖以及免疫學(xué)等領(lǐng)域帶來的新的突破。
一、單細胞基因測序行業(yè)：剛啟程，面臨引爆點
BCC Research的一項分析報告指出，2014年全球單細胞分析（Single-cell Analysis）的市場達5.4億美金，預(yù)測將從2015年的6.3億美金增長到2020年的16億美金，復(fù)合增長率達21%。根據(jù)GENReports的報告，關(guān)于單細胞分析的文章發(fā)表在過去的幾年也有著爆發(fā)性的增長。
圖2：單細胞分析的文章發(fā)表數(shù)量
資料來源：GEN，民生證券研究院
其中，傳統(tǒng)的單細胞基因組學(xué)主要是由基因芯片和PCR主導(dǎo)的，隨著二代基因測序的成本以超摩爾定律下降，目前單細胞基因組學(xué)逐漸由二代基因測序技術(shù)接棒。
和qPCR在90年代的發(fā)展一樣，目前所有的刺激因素（高度的科研興趣，生物醫(yī)藥巨頭公司的關(guān)注等）正在解鎖這個市場，單細胞基因測序行業(yè)正面臨引爆點。
二、單細胞基因測序的基本流程：單細胞分離--基因組擴增--測序和分析
單細胞測序，簡單地說，主要經(jīng)過如下的步驟：單細胞的分離--DNA/RNA的提取和擴增（全基因組擴增和全轉(zhuǎn)錄組擴增）---測序以及后續(xù)的分析和應(yīng)用。
圖3：單細胞測序的步驟
資料來源：Recent advances and current issues in single-cell sequencing of tumors，民生證券研究院
2.1 單細胞的捕捉和分離
單細胞測序的第一步是單細胞的分離和提取，目前的方法主要有如下幾種方法：流式細胞術(shù)，激光捕獲顯微切割技術(shù)以及微流控技術(shù)。
圖4：單細胞分離的三種方式：流式細胞術(shù)，激光捕獲顯微切割以及微流控技術(shù)
資料來源：Technologies for Single-Cell Isolation，民生證券研究院
1）流式細胞術(shù) （Flow Cytometry）
是指通過對于懸浮于流體中的細胞或者其他顆粒進行定量分析和分選的技術(shù)。在各種流式細胞儀中，大家主要討論的是熒光活化細胞分類計FACS（Fluorescence Activated Cell Sorting）系統(tǒng)分離單細胞。定量原理：待測細胞經(jīng)特異性熒光染料染色后，加入樣品管中，經(jīng)過測量區(qū)，由染色后的細胞在激光照射下的熒光產(chǎn)生的電信號來進行定量分析；分選原理：通過流束形成含有細胞的帶電液滴來實現(xiàn)的。
2）激光捕獲顯微切割技術(shù)Laser Capture Microdissection（LCM）
LCM技術(shù)可以在顯微鏡直視下快速、準確獲取所需的單一細胞亞群，甚至單個細胞，從而成功解決了組織中細胞異質(zhì)性問題。其基本原理是通過一低能紅外激光脈沖激活熱塑模-乙烯乙酸乙烯酯（EVA）膜，在直視下選擇性地將目標細胞或組織碎片粘到該膜上。
3）微流控技術(shù)（Microfluidics）
微流控技術(shù)是一種用于精確控制微量液體的技術(shù)。微流控芯片是實施該技術(shù)的平臺，通常通過細微的管道對液體實施操控，微流控對液體的操控尺度， 剛好適合于單細胞樣品的處理操作。
2.2 全基因組擴增 （Whole Genome Amplification. WGA）/ 全轉(zhuǎn)錄組擴增 （Whole Transcriptome Amplification，WTA）：單細胞測序的難點
2.2.1 主要的三種全基因組擴增技術(shù)，各有優(yōu)勢
由于在單細胞中的DNA和RNA的數(shù)量非常小（幾個pg），用傳統(tǒng)的測序儀無法檢測，所以科學(xué)家們必須首先對這些分子進行擴增，同時盡量的減少錯誤。目前的全基因組擴增技術(shù)主要有三種：簡并寡核苷酸引物PCR擴增（DOP-PCR），多重置換擴增（MDA）；和基于多次退火和成環(huán)的擴增循環(huán)（MALBAC）。
1）基于PCR技術(shù)的全基因組擴增技術(shù)，例如DOP-PCR（簡并寡核苷酸引物PCR擴增）
DOP-PCR是一種部分隨機引物法， 其引物構(gòu)成為3′-ATGTGG-NNNNNN-CCGACTCGAG-5′， 主要 利用3′端ATGTGG這6個在人體中分布頻率極高的堿基作為引導(dǎo)， 以6個堿基的隨機序列來決定特異的擴增起始位點，從而達到擴增整個基因組的目的。2）多重置換擴增（MDA）MDA是一種等溫的鏈置換擴增反應(yīng)， 其使用隨機的6堿基引物在多位點和模板鏈結(jié)合， 接著利用 phi29DNA 聚合酶很強的模板結(jié)合和置換能力實現(xiàn)對全基因組的擴增。
圖5：DOP-PCR和MDA全基因組擴增技術(shù)簡介
資料來源：Single-cell genome sequencing： current state of the science，民生證券研究院
3）MALBAC（Multiple annealing and looping-based amplification cycles）基于多次退火和成環(huán)的擴增循環(huán)
通過采用特殊引物，使得擴增子的結(jié)尾互補而成環(huán)，從而達到近乎線性的擴增，該技術(shù)是哈佛大學(xué)謝曉亮教授團隊發(fā)明的。
圖6：MALBAC全基因組擴增的示意圖
資料來源：Single-cell sequencing by Doug Brutlag，民生證券研究院
表1：三種類型的全基因組擴增方式比較
資料來源：Single-Cell Sequencing Technologies： Current and Future，民生證券研究院
Navin 在研究報告中指出（來源：Cancer genomics： one cell at a time），對于檢測CNV（Copy Number Variation）的時候，DOP-PCR以及MALBAC較有優(yōu)勢，另一方面， MDA方法一般用來檢測點突變。Gawad et al.， （2015）更是指出，三種全基因組擴增技術(shù)并沒有明顯的勝者，具體方法的使用取決于研究的目的。
2.2.2 全轉(zhuǎn)錄組擴增
一個哺乳動物的單細胞大約含有10pg的RNA，其中mRNA大約在0.1-0.5pg，并不能滿足目前測序平臺的要求，所以需要進行全轉(zhuǎn)錄組擴增技術(shù)。
單細胞中提取的RNA首先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，然后對逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA進行擴增。目前主要的轉(zhuǎn)錄組擴增技術(shù)主要包括如下幾種：傳統(tǒng)的PCR，改進的PCR，T7-in vitro 體外轉(zhuǎn)錄組擴增以及Phi29聚合酶擴增。
三、單細胞測序的主要應(yīng)用：癌癥，輔助生殖以及免疫學(xué)領(lǐng)域
當單細胞被分離，細胞內(nèi)的DNA/RNA被提取和擴增后，二代基因測序（Next Generation Sequencing）可以用來進行后續(xù)的測序。當把基因測序應(yīng)用于單個細胞層面，在下游應(yīng)用領(lǐng)域有著先天獨到的優(yōu)勢。
3.1單細胞基因測序技術(shù)有助研究癌癥起因和治療
首先談一下癌癥的異質(zhì)性：中晚期的腫瘤或由一系列的腫瘤克隆組成，每一種克隆有著獨立的變異，形態(tài)和藥物反應(yīng)。對于腫瘤克隆精準的診斷非常重要，因為一個占據(jù)原發(fā)性腫瘤5.1%的亞克隆種群在復(fù)發(fā)的時候可能成為主要的致病因素。
圖7：腫瘤的異質(zhì)性
資料來源：Illumina，民生證券研究院
實體瘤由一系列不同的細胞組成，包括癌癥纖維細胞，內(nèi)皮細胞，淋巴細胞，巨噬細胞等。同時，實體瘤由多個腫瘤克隆亞種群構(gòu)成，使得臨床樣本的分析更加復(fù)雜。當多個腫瘤克隆同時存在時，標準方法檢測的要么是平均信號要么是主要的克隆群體（并不一定是最致病的）的信號。
而同時，腫瘤的異質(zhì)性和癌癥產(chǎn)生抗藥性以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，所以，單細胞測序開始用來檢測腫瘤內(nèi)基因異質(zhì)性，對于癌癥起因以及后續(xù)治療的研究非常關(guān)鍵和重要。
例如，Navin et al.（2011）， 利用單細胞基因測序的方法（流式細胞術(shù)提取細胞-全基因組擴增-NGS），在某個乳腺癌腫瘤組織中檢測了100個乳腺癌細胞的CNVs，覆蓋度大約6%，發(fā)現(xiàn)了三種完全不一樣的克隆亞種群。
除了腫瘤細胞，單細胞基因測序同樣可以應(yīng)用于循環(huán)腫瘤細胞（Circulating tumor cells）和外周血播散腫瘤細胞DTC（disseminated tumor cells），該部分內(nèi)容將在后續(xù)的研究報告中深入討論。
3.2 單細胞基因測序助力輔助生殖
PGS（Pre-implantation Genetic Screening）是胚胎注入前遺傳學(xué)篩查，主要是通過檢測胚胎的23對染色體結(jié)構(gòu)、數(shù)目，來分析胚胎是否有遺傳物質(zhì)異常；PGD（Pre？implantation Genetic Diagnosis），主要用于檢測胚胎是否攜帶遺傳缺陷的基因，關(guān)于PGS/PGD的介紹，請參考我們之前的行業(yè)深度《基因+大數(shù)據(jù)的顛覆：從癌癥基因測序到輔助生殖》。
PGD過程中，目前主要有三種方式獲得活檢材料：1）卵子的第一極體和第二極體；2）培養(yǎng)至第3天胚胎卵裂期的卵裂球細胞（一般取1-2個細胞）；3）培養(yǎng)第5天左右的囊胚細胞。
例如，牛津大學(xué)的Dr.Dagan Wells團隊，通過對囊胚細胞進行單細胞基因測序，選擇健康的胚胎植入。另外，謝曉亮教授團隊通過對女方卵細胞極體細胞進行測序，結(jié)合胚胎選擇，選擇正常的胚胎移植。
圖8：卵母細胞減數(shù)分裂產(chǎn)生極體的過程
資料來源：Genome Analyses of Single Human Oocytes，民生證券研究院
（注：其中PB1和PB2是第一極體和第二極體）
3.3 單細胞基因測序打開免疫報多樣性研究之門
用單細胞基因測序分析免疫細胞的原因是現(xiàn)存的多樣的病原體導(dǎo)致了免疫細胞的高度異質(zhì)性，傳統(tǒng)的檢測方法，取樣來自一大堆細胞，低估了單個免疫細胞的多樣性，所以我們需要更加精確檢測單個免疫細胞的遺傳物質(zhì)，從而理解機體復(fù)雜的免疫機制。正如開篇提到的Juno收購的單細胞基因測序公司AbVitro致力于T細胞和B細胞的基因測序。
圖9展示了對單個T細胞受體基因測序（TCR Sequencing）的流程。TCR α和βmRNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄，擴增，重疊延伸，目的基因被選擇性地進行PCR擴增以及后續(xù)的分析。
圖9：TCR Sequencing過程
資料來源：Pairing of T-cell receptor chains via emulsion PCR，Illumina，民生證券研究院
四、單細胞基因測序未來的發(fā)展之路
在目前來看，單細胞基因測序還處在非常初級的階段，也面臨很多技術(shù)的挑戰(zhàn)，包括：如何高效的分離細胞，全基因組無偏差的擴增，以及下游的數(shù)據(jù)分析等。但各大生物醫(yī)藥巨頭都已經(jīng)目光鎖定了這個方向，除了今年初Juno收購AbVitro（單個T細胞和B細胞進行基因測序），去年八月BD公司收購了單細胞測序公司Cellular Research。Illumina也通過和Clontech合作，推出了單細胞RNA測序服務(wù)。
我們認為，未來的基因測序一定朝著更精準，更微觀的方向前進，如今，單細胞測序正面臨著一場革命，在單個細胞層面讓我們在前所未有的水平理解基因組學(xué)，表觀基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的多樣性。
背景案例：
2016年1月，腫瘤免疫療法的領(lǐng)頭羊公司Juno宣布以1.25億美金的股票和現(xiàn)金收購波士頓的一家單細胞測序公司：AbVitro Inc.。 AbVitro公司的技術(shù)起源于哈佛大學(xué)George Church的實驗室，AbVitro的技術(shù)包括對單個T細胞和B細胞進行基因測序，幫助科學(xué)家們理解T細胞受體（T cell receptor）α和β鏈的基因的復(fù)雜性。
圖：Juno收購AbVitro之后的布局
