2005年，世界上首臺新一代測序儀問世，并且很快就被應(yīng)用到了如火如荼的醫(yī)藥領(lǐng)域當(dāng)中。不論應(yīng)用于何種疾病，新一代測序技術(shù)都能夠在個性化醫(yī)療（personalized medicine）領(lǐng)域占據(jù)一席之地，因為可以根據(jù)每個人的基因組將患有相同，或者不同疾病的患者分成不同的種類。由于制藥公司也開始轉(zhuǎn)變策略，從過去熱衷于開發(fā)“重磅炸彈”式 的藥物（blockbuster drugs，寓指市場反響強烈、利潤很高的拳頭產(chǎn)品）逐漸轉(zhuǎn)向開發(fā)靶向治療藥物（targeted therapeutics），而且這些靶向藥物的用藥基礎(chǔ)正是患者之間的基因組及分子差異（變異），所以開發(fā)一種簡便、快捷、準(zhǔn)確，同時成本又不太高的測序診斷技術(shù)就顯得尤為重要。
第一代測序技術(shù)
20世紀(jì)70年代，分別由Fredrick Sanger和Walter Gilbert領(lǐng)導(dǎo)的這兩個課題組一直在暗中較勁，他們都發(fā)表了詳細(xì)介紹當(dāng)時尚處于起步階段的第一代測序技術(shù)的文章。 Gilbert的方案是所謂的化學(xué)降解法，即先對DNA鏈進(jìn)行化學(xué)修飾，然后對放射性標(biāo)記的DNA末端進(jìn)行切割，再進(jìn)行凝膠電泳，最后通過放射自顯影的方法來讀取DNA序列。Sanger的策略則完全不同，他的方法是所謂的鏈終止法（chain termination technique），他使用的雙脫氧核糖核酸（dideoxynucleotides）能夠使延伸中的DNA鏈終止延伸，從而得到DNA序列信息。由于Sanger測序法用熒光標(biāo)記的引物取代了Gilbert測序法里的放射性引物，同時用毛細(xì)管電泳取代了凝膠電泳，所以Sanger測序法逐漸成為了科學(xué)研究和臨床實驗室里首選的測序金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。耗時長達(dá) 13年之久，總計花費27億美元的人類基因組計劃（Human Genome Project, HGP）也是依靠Sanger測序法才得以最終完成的。不過 Sanger測序法因為測序的通量太低，同時價格又太高，所以不適于分析復(fù)雜的二倍體基因組序列。于是科學(xué)家們又開始著手開發(fā)新一代測序技術(shù)。
當(dāng)今的測序技術(shù)
目前，新一代測序儀市場主要由以下這3家公司把持，他們分別是生命科技公司（Life Technologies）、Illumina公司和羅氏公司（Roche）。這些新一代測序技術(shù)和Sanger測序技術(shù)最大的區(qū)別在于能夠進(jìn)行大規(guī)模的平行測序（massively parallel sequencing），所以測序的時間和費用都有了極大的降低，并且能夠獲得數(shù)十億條序列信息（sequence reads）。在這些公司生產(chǎn)的新一代測序儀里，每一種化學(xué)標(biāo)記技術(shù)都是獨家專利，不過基本的原理都是非常簡單的，即在DNA PCR擴增時，借助這些化學(xué)標(biāo)志物在堿基插入 DNA鏈時發(fā)出的信號來讀取序列信息，這些信號可以是光信號，也可以是H+流信號（H ion ?uxes）。SOLiD、HiSeq、GS FLX等最初級的新一代測序儀主要偏向的都是科研應(yīng)用領(lǐng)域，可以在數(shù)天的時間內(nèi)獲得大量的DNA序列數(shù)據(jù)。不過這個速度還是不能滿足臨床應(yīng)用的需求，在臨床工作中需要速度更快的測序儀，同時也需要體積更小巧一點的測序儀，所以各大測序儀生產(chǎn)廠家又相繼推出了新產(chǎn)品，比如生命科技公司基于離子流技術(shù)開發(fā)的Ion Torrent PGM測序儀，Illumina公司的 MiSeq，和羅氏公司的GS Junior等。這些新產(chǎn)品讓新一代測序儀走進(jìn)了臨床，成為了在臨床診斷實驗室里常見的設(shè)備。
新一代測序技術(shù)的臨床應(yīng)用
自2010年以來，使用新一代測序儀的臨床試驗數(shù)量有大幅度的增加（表2）。這些臨床試驗開展的測序工作無所不包，有全基因組測序，也有全外顯子組測序，還有RNA測序和定向測序（targeted sequencing）。不論采取哪種測序方式，所有這些臨床試驗都是為了發(fā)現(xiàn)致病的遺傳異常，并且根據(jù)這些異常信息來指導(dǎo)臨床診療工作。與此同時，這些信息也有助于生物制藥企業(yè)開發(fā)出更多的靶向治療藥物，也可以幫助他們了解某些藥物產(chǎn)生耐藥性的原因。以下為使用新一代測序儀作為主要檢測手段的腫瘤研究項目一覽表
| 研究項目 | 項目贊助人 | 國際臨床試驗注冊NCT號 | 項目開始時間 | 研究疾病 | 項目簡介 | 采用的測序技術(shù) |
| 血漿乳腺癌特異性DNA檢測項目 | Dartmouth-Hitchcock醫(yī)學(xué)中心（Dartmouth-Hitchcock Medical Center） | NCT01617915/6 | 2012年10月 | 乳腺癌 | 分析乳腺癌細(xì)胞內(nèi)的染色體重排和基因組異常情況 | 全基因組測序 |
| 唐氏綜合癥及急性髓細(xì)胞樣白血病全外顯子組測序研究項目 | 兒童癌癥組織(Children’s Oncology Group) | NCT01507441/10 | 2012年2月 | 白血病 | 對白血病和唐氏綜合癥患兒的DNA標(biāo)本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其中的異常情況 | 全外顯子組測序 |
| 研究兒童腎上腺皮質(zhì)腫瘤患者標(biāo)本里的基因 | 兒童癌癥組織(Children’s Oncology Group) | NCT01528956/10/ | 2012年2月 | 腎上腺皮質(zhì)腫瘤 | 對腎上腺皮質(zhì)腫瘤患者的基因進(jìn)行研究 | 全基因組測序 |
| 開展定向測序及全基因組測序臨床研究的可行性探討 | 多倫多大學(xué)的教學(xué)醫(yī)院聯(lián)盟(University Health Network, Toronto) | NCT01345513/150/ | 2011年3月 | 實體瘤 | 發(fā)現(xiàn)癌癥患者體內(nèi)的突變基因 | 全基因組測序 |
| 利用全基因組測序技術(shù)對晚期癌癥患者進(jìn)行的輔助性中試 | 美國斯科特斯戴爾醫(yī)護中心(Scottsdale Healthcare) | NCT01443390/10/ | 2011年9月 | 晚期癌癥 | 對使用了尚處于臨床試驗1期階段的抗癌藥物的腫瘤患者進(jìn)行調(diào)查，了解其療效 | 全基因組測序 |
| 癌癥基因組分析項目 | 韓國首爾國立大學(xué)醫(yī)院（Seoul National University Hospital） | NCT01458604/100/ | 2011年8月 | 惡性腫瘤 | 發(fā)現(xiàn)與藥物相關(guān)的遺傳變異，并對其進(jìn)行分析 | 定向測序、全外顯子組測序以及RNA測序 |
| 在急性髓細(xì)胞樣白血病嬰兒患者的組織標(biāo)本中尋找RNA生物標(biāo)志物 | 兒童癌癥組織（Children’s Oncology Group） | NCT01229124/20/ | 2010年10月 | 白血病 | 分析患者的組織樣品，尋找新的RNA生物標(biāo)志物 | RNA測序 |
| 對實體瘤進(jìn)行分子學(xué)分析 | 圣裘德兒童研究醫(yī)院（St. Jude Children’s Research Hospital） | NCT01050296/360/ | 2010年1月 | 兒科實體瘤 | 分析腫瘤的基因表達(dá)譜，尋找遺傳突變 | 全基因組測序 |
| 對乳腺癌的轉(zhuǎn)錄組（Transcriptome）進(jìn)行深度測序 | 美國阿肯色大學(xué)（University of Arkansas） | NCT01141530/30/ | 2009年9月 | 乳腺癌 | 研究雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）及人表皮生長因子受體2（HER-2）三陰性乳腺癌的轉(zhuǎn)錄組調(diào)控情況 | RNA測序 |
1. 腫瘤分子診斷領(lǐng)域
新一代測序技術(shù)（ NGS）已經(jīng)走進(jìn)了臨床，在很多臨床應(yīng)用領(lǐng)域里占據(jù)了一席之地，尤其是在腫瘤分子診斷領(lǐng)域（cancer molecular diagnostics）更是當(dāng)仁不讓的主力軍，因為臨床醫(yī)生們需要根據(jù)患者的個體基因組信息對他們進(jìn)行區(qū)分，實施個性化診療工作。隨著諸如專門針對 EGFR突變陽性肺腺癌患者的Tarceva等靶向治療藥物的誕生，臨床上也依托免疫組化（immunohistochemistry）、DNA芯片（DNA microarray）、或者RT-PCR等技術(shù)相應(yīng)地開展了一系列單基因檢測項目（single gene tests）。隨著我們對腫瘤基因組認(rèn)識的不斷加深，隨著大量的靶向抗癌藥物進(jìn)入臨床試驗，我們相信，未來腫瘤科醫(yī)生一定會有更多、更有效的手段來對抗腫瘤。由于腫瘤基因組測序會得到腫瘤細(xì)胞基因組中的絕大部分序列，其中還包括轉(zhuǎn)位（translocations）等多種突變信息，所以利用新一代測序儀也可以開展預(yù)后評估和療效預(yù)測等方面的工作，幫助臨床醫(yī)生為每一位患者挑選出最合適的治療方案。
比如通過全基因組測序就在一位急性髓細(xì)胞樣白血?。╝cute myeloid leukemia）患者的基因組中發(fā)現(xiàn)了一種新的插入融合突變（insertional fusion），即經(jīng)典的bcr3 PMLRARA融合基因（bcr3 PML-RARA fusion gene），也正是因為這一發(fā)現(xiàn)，這位患者的主治醫(yī)生才為他重新設(shè)計了一套治療方案。通過對癌癥患者進(jìn)行全基因組測序，臨床醫(yī)生們可以根據(jù)檢測結(jié)果設(shè)計出專屬于這位患者自己的特異性探針，有了這對探針，醫(yī)生們就可以監(jiān)測患者的治療效果，了解病情是否有復(fù)發(fā)，而所需的只是患者的一點血液而已。隨著科研工作的不斷發(fā)展，將來肯定會發(fā)現(xiàn)更多的生物標(biāo)志物（biomarker），開發(fā)出更多的靶向治療藥物，這都會豐富臨床醫(yī)生的診療手段，讓他們?yōu)槊恳晃换颊叨贾贫ǔ鲎詈线m的診療方案。
目前歐洲學(xué)界普遍認(rèn)為，NGS取代桑格測序技術(shù)（Sanger sequencing）進(jìn)行BRCA檢測是未來市場的趨勢。它的優(yōu)勢在于較低的測序成本、快速的Turnaround時間、簡單的實驗操作和后期的數(shù)據(jù)分析。BRCA是Breast Cancer Susceptibility Gene的縮寫。BRCA
基因變異最早被發(fā)現(xiàn)與女性的乳腺癌和卵巢癌發(fā)病有密切的關(guān)系。BRCA1和BRCA2屬于抑癌基因，叫乳腺/卵巢腫瘤感基因。正常細(xì)胞中，BRCA1和BRCA2可以幫助DNA損傷修復(fù)和維護DNA完整，防止癌細(xì)胞的產(chǎn)生。如果 BRCA1/2產(chǎn)生基因變異，失去了這一保護，細(xì)胞產(chǎn)生癌變的幾率大大增加。而BRCA2基因變異與男性的乳腺癌，胰腺癌和前列腺癌有密切關(guān)系。前段時間著名影星Angelina Jolie自爆已接受預(yù)防性雙側(cè)乳腺切除術(shù)，因為她本人罹患乳腺癌的風(fēng)險極高。38歲的美國女星Angelina Jolie在《紐約時報》上發(fā)表了《我的醫(yī)療選擇》一文，稱由于自己攜帶有 BRCA1基因，醫(yī)生估計她患上乳腺癌的風(fēng)險高達(dá)87%，患上卵巢癌的風(fēng)險高達(dá)50%，她母親在56歲時死于癌癥。朱莉說切除術(shù)后，她患上乳腺癌的風(fēng)險已降至5%。日后，有與安吉麗娜•朱莉同樣擔(dān)憂的女性就可以借助 NGS技術(shù)進(jìn)行BRCA檢測，提早采取相關(guān)措施。
2. 遺傳病篩查領(lǐng)域
新一代測序技術(shù)對于新生兒孟德爾式遺傳病篩查項目（screening of newborns for Mendelian disorders孟德爾遺傳?。┮埠苡袔椭ＥR床醫(yī)生們通常都會根據(jù)表型與基因型的關(guān)系（phenotype -genotype correlations）進(jìn)行單基因遺傳檢測，以此來明確診斷。不過孟德爾式遺傳病也能夠以非常復(fù)雜的形式存在，同一種表型可能是由多個基因來決定的，其中就有可能存在目前尚未被發(fā)現(xiàn)的基因。在這種情況下單基因檢測就顯得無能為力了，可新一代測序技術(shù)解決起這種問題來卻毫不費力，能夠以極快的速度搞定這一切。最近兒童慈善醫(yī)院（Children's Mercy Hospital）就成功地在50個小時內(nèi)確診了592種罕見的兒童疾病，這個活生生的例子生動地展示出了新一代測序儀在臨床應(yīng)用工作中的巨大潛力。
3. 產(chǎn)前診斷領(lǐng)域
在產(chǎn)前診斷方面（ prenatal diagnosis），以新一代測序技術(shù)為依托的創(chuàng)新檢測手段也將會徹底改變傳統(tǒng)的診療模式。 Sequenom公司的分子醫(yī)學(xué)中心（Center forMolecular Medicine）目前就推出了一種名為 MaterniT21的產(chǎn)前診斷項目，這是一種非侵入式的產(chǎn)前檢測手段（non invasive prenatal test），能夠診斷21三體綜合癥（trisomy 21）。只需要抽取孕婦一點點血液，檢測其中微量的胎兒21號染色體就夠了。這種非侵入式的產(chǎn)前檢測手段，以及類似的檢測13三體或者18三體綜合癥的檢測手段都具有非常高的敏感度和特異性，一定能夠在產(chǎn)前檢查領(lǐng)域里找到自己的位置。
另外，最近由Y.M. Dennis Lo和 Stephen Quake領(lǐng)導(dǎo)的研究小組利用新一代測序技術(shù)檢測到了胎兒染色體的非整倍體（chromosomal aneuploidy）情況。之前的工作已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在孕婦的血液當(dāng)中含有胎兒的核酸DNA和RNA（非細(xì)胞內(nèi)的游離核酸），同時也含有母體自身的游離核酸分子（非細(xì)胞內(nèi)的核酸）?？茖W(xué)家們開發(fā)出了多項使用這種游離的核酸分子進(jìn)行分析和研究的技術(shù)，比如對胎盤中的目標(biāo)染色體（比如21號染色體）來源的mRNA進(jìn)行檢測，又或者用數(shù)字PCR分析技術(shù)（digital PCR analysis）對大量的目標(biāo)染色體位點進(jìn)行相對定量檢測（與參考染色體位點對比）等，用這類技術(shù)可以確定胎兒是否存在非整倍體畸形的情況。
基于染色體相對定量的概念， Lo和 Quake的團隊分別發(fā)現(xiàn)可以將母體血液里分離得到的游離 DNA轉(zhuǎn)化成 Illumina文庫（Illumina library），然后進(jìn)行測序，最后將測序結(jié)果與人類參考基因組比對，確定這些序列在人類參考基因組中的位置。通過計算測出每一條染色體上的序列數(shù)量，可以得到每一條染色體的相對定量結(jié)果。如果胎兒真的存在非整倍體的情況，那么測得的結(jié)果就會明顯的超出正常值。這項技術(shù)的準(zhǔn)確性已經(jīng)在檢測21三倍體的產(chǎn)前診斷工作中得到了驗證，在檢測 18三倍體和13三倍體的產(chǎn)前診斷工作中也取得了很好的成績。這些研究工作預(yù)示著一種新的胎兒非整倍體檢測技術(shù)正式誕生，也為在病理和非病理情況下用新一代測序技術(shù)對細(xì)胞外的游離DNA進(jìn)行檢測和分析提供了堅實的試驗依據(jù)。
4. 感染性疾病和公共衛(wèi)生監(jiān)測領(lǐng)域
新一代測序技術(shù)還可以用于感染性疾病和公共衛(wèi)生監(jiān)測（infectious disease and public health surveillance）等領(lǐng)域。最近，美國國立健康研究院（NIH）公布了一項研究結(jié)果，匯報了他們在跟蹤一次爆發(fā)疾病傳播時使用實時測序（real time sequencing）技術(shù)的情況。2011年，中歐爆發(fā)了一次致命性的出血性腸道感染（hemorrhagic intestinal infection），當(dāng)時NIH就使用生命科技公司的 Ion PGM測序儀快速地找到了致病元兇——一種致死性的大腸桿菌（E. coli）。在醫(yī)療機構(gòu)里，也可以使用新一代測序技術(shù)來跟蹤耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA（即所謂的超級細(xì)菌）的傳播情況，目前英國正有科研人員使用新一代測序技術(shù)為所有的MRSA菌株編輯、整理一個數(shù)據(jù)庫。
新一代測序技術(shù)能夠讓科研人員發(fā)現(xiàn)腫瘤基因組里的突變，還可以應(yīng)用于產(chǎn)前診斷（prenatal diagnostics）、病原體檢測（pathogen detection），以及遺傳突變（genetic mutations）篩查等。雖然在臨床工作中早已經(jīng)采用Sanger測序、PCR、基因芯片等技術(shù)來檢測遺傳突變，但是這些方法都有各自的局限性，其檢測能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及新一代測序儀。比如，雖然基因芯片可以檢測出單堿基突變（single nucleotide variants, SNV），但是卻不能夠發(fā)現(xiàn)大規(guī)模的DNA異常，例如大范圍的堿基缺失，或者DNA結(jié)構(gòu)異常等突變，可是在腫瘤基因組中這些突變都是非常常見的。相比之下，全外顯子組測序（whole exome sequencing）和全基因組測序（whole genome sequencing）能夠準(zhǔn)確地、全面地發(fā)現(xiàn)基因組中的各種DNA異常、遺傳重組突變和其它各種突變。由此可見，新一代測序技術(shù)是一種非常好的診斷技術(shù)，同時也是很有用的預(yù)后預(yù)測技術(shù)，能夠幫助臨床醫(yī)生們準(zhǔn)確地判定出每一位患者的特點，為個性化醫(yī)療的順利開展鋪平道路。
小結(jié)
與任何一種檢測手段走入臨床一樣，最開始，新一代測序儀在臨床機構(gòu)中的廣泛應(yīng)用速度是非常緩慢的，除非取得了重大的突破，在倫理、技術(shù)、結(jié)果解析以及管理等相關(guān)領(lǐng)域存在的各種問題都得到了很好的解決。其中最重要的一個問題就是如何分析、解讀海量的測序結(jié)果，這也是相當(dāng)費錢的一項工作。這就需要臨床生物信息學(xué)家和受過專門訓(xùn)練的臨床醫(yī)生們能夠慧眼識珠，從海量的測序結(jié)果當(dāng)中挑選出最有意義、對疾病診療工作最有價值的測序結(jié)果。
除此之外，保險公司和衛(wèi)生監(jiān)管部門也都必須積極地參與進(jìn)來，讓他們確保采用新一代測序技術(shù)的檢測項目都能夠完成標(biāo)稱的檢測內(nèi)容，達(dá)到標(biāo)稱的檢測目的。在這方面，包括美國疾病預(yù)防控制中心專門負(fù)責(zé)實驗室檢驗標(biāo)準(zhǔn)的部門（Centers for Disease Control Division for Laboratory Science and Standards）以及美國病理學(xué)家學(xué)會（College of American Pathologists）在內(nèi)的多個機構(gòu)都已經(jīng)行動起來，制定出了相關(guān)的管理細(xì)則，對測序檢測項目的準(zhǔn)確性、敏感性、特異性和可報告（應(yīng)用）的范圍等指標(biāo)進(jìn)行了定義和規(guī)范。這些工作還將明確有關(guān)新一代測序檢測業(yè)務(wù)的具體賠償事項。
